RT-PCR: sin ver cómo puede medir los niveles de expresión de ARNm
Según tengo entendido, en RT-PCR comenzamos con una molécula de ARNm, usamos la enzima transcriptasa inversa para crear una copia de ADNc (creando así un híbrido de ARNm / ADNc de doble hebra), degradamos el ARNm y finalmente creamos una hebra complementaria para el ADNc con una ADN polimerasa. Si finalmente estamos creando ADN y se está duplicando en cada ciclo, ¿cómo podemos deducir la cantidad original de ARNm en nuestra muestra? Parece que necesitaríamos combinarlo con algún otro método, pero muchas fuentes que estoy viendo parecen implicar que la RT-PCR por sí sola es suficiente para "cuantificar" la cantidad de ARNm en una muestra. Cualquier pensamiento sobre esto es bienvenido
Respuestas
Puede haber una confusión de terminología. Existe una PCR cuantitativa en tiempo real, que a veces se puede llamar RT-PCR. También existe la PCR con transcriptasa inversa, que también se llama de manera confusa RT-PCR. Para tratar de reducir la confusión, la PCR cuantitativa en tiempo real también se denomina RT-qPCR o qPCR.
Lo que describe en su pregunta es el tipo de PCR con transcriptasa inversa. Esto se usa para amplificación, no cuantificación, de material de partida.
QPCR o PCR cuantitativa, por otro lado, utiliza tintes fluorescentes para medir la cantidad de producto génico amplificado. Los estándares proporcionan una medida de referencia de la cantidad de material genético que debe esperar ver con el tiempo, en cada ciclo de PCR, para una determinada cantidad de fluorescencia medida. Medir la fluorescencia de su propia muestra a lo largo del tiempo y compararla con el estándar le da una estimación de lo que comenzó inicialmente.
Solo quería ampliar la respuesta anterior con respecto a la confusión entre la PCR en tiempo real (cuantitativa) y la transcripción inversa (RT). RT-qPCR se refiere a PCR cuantitativa en tiempo real, pero algunas organizaciones se abstienen de cualquier referencia a la cuantificación (porque en realidad es solo semicuantitativa), en lugar de utilizar la nomenclatura rRT-PCR (PCR en tiempo real de transcripción inversa, supongo). En cualquier caso, esta técnica es teóricamente capaz de cuantificar las copias de ARNm utilizando el diseño de ensayo y los estándares adecuados.
El principio general es que, después de que el ADNc se transcribe de forma inversa a partir del ARN, se amplifica de manera similar a una reacción de PCR normal. Esto se puede lograr en una sola reacción con una mezcla maestra que contiene los reactivos de transcripción inversa y qPCR, o en dos reacciones separadas, primero realizando una RT primero y luego una qPCR estándar en el ADNc resultante. El método todo en uno requiere menos reactivos y menos tiempo, pero puede ser difícil optimizar ambas reacciones al mismo tiempo.
Aquí hay una buena introducción al diseño de ensayos de qPCR . Como se indicó en la respuesta anterior, la cuantificación proviene de alguna medida de fluorescencia relacionada con la cantidad de producto de amplificación presente. En una reacción optimizada, el número de amplicones debe duplicarse con cada ciclo, lo que permite la cuantificación en función de cuántos ciclos ocurren antes de que cada pozo de reacción alcance un umbral de fluorescencia específico. Los colorantes intercalados como SyberGreen cuantifican el ADN total presente, mientras que las sondas fluorescentes son más específicas para el gen de interés. Debido a que es solo semicuantitativo, se incluye una serie de diluciones estándar de concentración conocida en cada placa y se utiliza para la cuantificación. Los estándares deben ser del mismo material y secuencia que su gen de interés (ADN o ARN) y deben diluirse en un rango de concentraciones que probablemente incluirán la concentración en sus muestras experimentales. También debe tener cuidado con la posibilidad de degradación de sus estándares, ya que la calidad de su cuantificación depende completamente de la calidad de sus estándares.
Un enfoque alternativo es cuantificar un gen de interés en relación con algún gen de referencia que se expresa de forma constitutiva en el mismo nivel independientemente de la muestra experimental. Este método (a veces llamado método delta-delta Ct ) elimina la necesidad de ejecutar una curva estándar, pero requiere reacciones adicionales o multiplexación, además de identificar un gen de referencia estable con cebadores y posiblemente sondas que funcionarán bajo las mismas condiciones de termociclado que su gen de interés.
Una tercera opción es la cuantificación absoluta mediante PCR digital (dPCR). Un problema con qPCR en general es que, incluso cuando se procesan muestras por duplicado o triplicado, puede ser difícil resolver con seguridad las diferencias en la cuantificación menores de aproximadamente 3 veces. Ingrese cuantificación absoluta. El dPCR funciona dividiendo la reacción en decenas de miles de compartimentos de tamaño nanométrico, de modo que cada compartimento puede contener o no una copia real de su gen de interés. La fluorescencia solo se usa al final de la reacción para determinar si cada compartimento se ha amplificado o no (por lo tanto, digital, cada compartimento es un 1 o un 0). La cuantificación se calcula determinando la proporción de compartimentos positivos a negativos y comparándola con una distribución de Poisson para distribuciones de probabilidad discretas. Puede tener una resolución mucho más fina que la qPCR, supuestamente capaz de detectar de manera confiable una diferencia de 1,2 veces en las concentraciones, con la desventaja de que tiene un rango menos dinámico con una confianza reducida en las estimaciones de cuantificación cerca de la parte superior e inferior de ese rango. Además, el sistema completo suele ser mucho más caro en casi todos los niveles (equipo, reactivos y consumibles). Pero con la mayoría de los ensayos de expresión génica, realmente debe preguntarse si un cambio de 1.2 veces en el nivel de transcripción será significativo en su sistema biológico.