게놈 어셈블리에 대한 오염

Nov 10 2020

커뮤니티에 대한 질문이있었습니다.

저는 150pb Illumina paired-end를 통해 시퀀싱 된 새로운 종의 게놈을 가지고 있습니다.

어셈블리의 품질을 확인하기 위해 나는 BUSCO pipeline내 종의 게놈에서 분류군에 존재하는 BUSCO 유전자 (중복되지 않은 유전자)의 99 %를 검색 할 수있는를 사용했습니다.

전 세계적으로 저는 18%BUSCO 유전자 만 놓쳤습니다. 즉, 어셈블리가 그리 나쁘지 않습니다.

이제 G + C % 와 BUSCO 유전자를 포함하는 모든 스캐 폴드 의 적용 범위 를 플로팅 할 때 (따라서 사전 오염되지 않음) 상당히 균질 한 구름을 찾을 수 있습니다.

대신 두 가지 커버리지 프로필 (아래에 빨간색과 파란색으로 표시됨)이 생깁니다.

그런 다음 4x 부근의 낮은 커버리지 시퀀싱 프로파일이 아카리 안과 같은 진핵 오염 물질 일 수 있다고 생각했지만,이 낮은 커버리지 스캐 폴드에 존재하는 BUSCO를 폭발 시키면 내 종의 게놈에 매우 가까운 히트를 얻습니다.

이게 뭔지 아는 사람 있나요?

다음은 contigsTable.csv그림에서 두 개의 첫 번째 행이 낮은 커버리지를 가진 스캐 폴드이고 마지막 두 개가 높은 커버리지를 가진 스캐 폴드 인 출력입니다.

FRC 출력

커버리지 분포

다음은 어셈블리의 Icarus 요약입니다.

Assembly
# contigs (>= 0 bp) 1038631
# contigs (>= 1000 bp) 120132
# contigs (>= 5000 bp) 22245
# contigs (>= 10000 bp) 9986
# contigs (>= 25000 bp) 1322
# contigs (>= 50000 bp) 97
Total length (>= 0 bp) 655530043
Total length (>= 1000 bp) 451497861
Total length (>= 5000 bp) 260894112
Total length (>= 10000 bp) 174183054
Total length (>= 25000 bp) 45006012
Total length (>= 50000 bp) 5956145
# contigs 214542
Largest contig 120620
Total length 519138286
GC (%) 32.94
N50 5062
N75 1624
L50 21982
L75 71030
# N's per 100 kbp 22.28

다음은 BUSCO 요약입니다.

2544 Complete BUSCOs (C)
2312 Complete and single-copy BUSCOs (S)
232 Complete and duplicated BUSCOs (D)
1060 Fragmented BUSCOs (F)
811 Missing BUSCOs (M)
4415 Total BUSCO groups searched
C:57.7%[S:52.4%,D:5.3%],F:24.0%,M:18.3%,n:4415

편집하다

다른 정렬 기 (MEGAHIT)를 사용하여 fastq 시퀀스를 실행하여 어셈블리 문제로 인한 것이 아닌지 확인하고 여기에서 볼 수있는 동일한 프로파일 범위를 얻었습니다.

답변

5 BastianSchiffthaler Nov 11 2020 at 15:14

이것은 유기체에 따라 다를 수 있습니다. 지금까지 정보가 많지 않으므로 몇 가지 더 확인하겠습니다.

FRC_align 과 같은 것을 실행하십시오 . 의심스러운 것으로 표시된 지역과 커버리지 그래프간에 명확한 신호가 있는지 확인합니다.

진핵 생물인가요? 식물? 플롯에서 미톤 드리아와 엽록체가 어디에 있는지 확인합니다. 어셈블리의 나머지 부분과 다른 GC / 커버리지 신호를 가지므로 괜찮습니다.

오염이 걱정 되십니까? 원시 데이터에서 kraken2 를 실행 하고 얻을 수있는 내용을 확인하십시오.

RepeatMasker를 실행 하고 반복 영역이 표시되는 효과에 기여하는지 확인합니다.

마지막으로, 표본이 낮은 이형 접합성, 반수체 또는 근친 교배가 아니라면 배수성으로 인해 약간의 영향을 미칠 수 있습니다. 이를 확인하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. MUMmer가 포함 된 자체 도트 플롯과 커버리지 히스토그램을 보는 것이 좋은 시작입니다. 아이디어는 두 개의 봉우리를보아야한다는 것입니다 (이배체라고 가정합시다). 하나는 분할 된 haplotigs 용이고 다른 하나는 붕괴 된 용입니다.

주문하신 게놈 45 개의 GC 분포를 확인했습니다. 모든 곳에서 발생하지만 몇 가지 이중 모드가 있습니다.

GC 대 길이는 어떻게 생겼습니까? 다음은 위에서 언급 한 45 개의 게놈 중 하나입니다.

KamilSJaron Nov 13 2020 at 03:58

그것은 참으로 수수께끼입니다. 내 추측으로는 일부 BUSCO를 운반하더라도 오염이 될 것입니다. 저는 blobtools를 통해 모든 de-novo 게놈을 실행합니다. 이렇게하면 수동으로 만든 것과 비슷한 플롯이 생성되지만 분류 학적 주석도 추가됩니다. 다음과 같이 보일 수 있습니다.

또한 낮은 커버리지 인 게놈의 비율은 얼마입니까? 상당한 스팬이 있습니까? 거의 항상 드 노보 어셈블리에서 낮은 커버리지를 가진 작은 콘티 그를 볼 수 있지만 일반적으로 게놈의 매우 작은 부분을 나타냅니다.

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한 가지 더 생각해 보면, 4 배체 종이 없다고 확신하십니까? 두 커버리지 피크는 8 배와 32 배에 해당합니다. 하나는 다른 것의 1/4입니다. 이러한 종류의 데이터 문제 를 조사하기 위해 몇 가지 도구를 개발했습니다 .

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댓글 몇 개만 더 있습니다. 커버리지 차이에는 다양한 이유가있을 수 있지만 모든 시퀀싱 편향으로 인해 분포가 왜곡 될 수 있으므로 커버리지의 명백한 이중 모드 (두 개의 2D 플롯에서 더 분명함)는 두 가지 다른 소스를 제안합니다. 일반적으로, 다양한 배수성 수준 또는 박테리아, 내생 혈관 또는 다른 종의 DNA 분리에 의한 오염 때문일 수 있습니다. 배수성이 배제되었으므로 오염으로 귀결되며 오염이 무엇인지 파악하기 위해 위에서 좋아하는 도구를 권장합니다.