Einzelzell-RNAseq-Zellcluster (echter Cluster oder Subcluster)
Ich versuche, ~ 5000 Sinngle-Zellen mit Seurat zu versorgen. Ich erwarte, dass mindestens 15 Zelltypen in den Daten vorhanden sind. Ich habe versucht, es mit mehreren Bedingungen auszuführen. Ich kann sehen, dass es 27 Cluster gibt. Ich glaube, viele von ihnen könnten Subcluster sein. Gibt es eine Möglichkeit zu wissen, welche Cluster tatsächlich Untercluster sind?
Wie von den Mitgliedern vorgeschlagen, habe ich clustree verwendet, um die Clusterstabilität zu überprüfen. Außerdem wird der Clustering-Parameter geändert.
Antworten
Es würde mich nicht wundern, wenn die 15 Zelltypen, die Sie erwarten, größtenteils über "proteinbasierte" Methoden charakterisiert würden. Antikörperfärbung, Durchflusszytometrie unter Verwendung von Fluorophor-gekoppelten Antikörpern, ... Die Daten, dass scRNA-seq auf RNA basiert und nicht die gleichen Informationen liefern sollten wie Assays auf Proteinbasis. Darüber hinaus sind die scRNA-seq-Daten, insbesondere diejenigen aus mikrofluidischen Systemen wie 10x, spärlich und reichen möglicherweise nicht aus, um eng verwandte Zelltypen / -zustände wie die von T-Zellen aufzulösen.
Darüber hinaus ist die Bewertung von Clustern oder die Clusterstabilität eine schwierige Aufgabe, und meiner Erfahrung nach können einige Cluster-Bewertungsmetriken aufgrund der Schergröße der Daten nicht einfach auf Einzelzelldaten angewendet werden. Nachdem ich Ihre Frage gestellt und nach Antworten gesucht habe (und das mache ich immer noch), mache ich Folgendes:
i) Versuchen Sie, so viel wie möglich transkriptomische Marker zu verwenden. Selbst dann würde das Fehlen eines Markers in Bezug auf die scRNA-Sequenz nicht viel bedeuten, es könnte sehr wohl nicht einfach aufgrund der Empfindlichkeit nachgewiesen werden
ii) Verwenden Sie Clustree , um die plausibelste Anzahl von Clustern auszuwählen (Auflösungsparameter in Seurat). Das Paket ist mit Seurat und einigen anderen scRNA-seq-Paketen kompatibel.
iii) Verwenden Sie die Silhouette-Breite als Metrik für das Clustering. Dies ist rechenintensiv, sollte jedoch für Ihre 5000 Zellen in Ordnung sein. Für größere Zellenzahlen verwende ich ein anderes Paket, das sich diesem annähert (fügt einen Link hinzu, aber zuerst habe ich meine Skripte nach dem Namen durchsucht).
iv) Überprüfen Sie, ob Batch-Effekte für das verantwortlich sind, was Sie als "Sub-Cluster" bezeichnen. Beispielsweise können die obigen Cluster 0, 14, 24 und 25 verschiedenen Proben entsprechen, die an verschiedenen Tagen verarbeitet wurden.
Sie sollten im Internet nach Methoden suchen, um die Clusterstabilität zu bewerten. Die Idee ist, Cluster durch zufälliges Addieren und Subtrahieren von Zellen eines bestimmten Clusters zu permutieren und zu sehen, ob er kollabiert oder nicht. Ich würde wetten, dass viele Ihrer Cluster nicht stabil sind, z. B. 17 und 2. Versuchen Sie, die Clustering-Parameter zu ändern, um die Auflösung zu verringern, um größere Cluster zu erhalten. Ich bin kein Seurat-Benutzer, aber normalerweise gibt es Auflösungs- und Parameter für den nächsten Nachbarn. Überprüfen Sie die Dokumentation. Siehe zum Beispiel Abschnitt 10.6 inhttps://osca.bioconductor.org/clustering.html ebenso gut wie https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.05.26.116640v1 als Inspiration für die Bewertung der Clusterstabilität.