Quantificação da expressão gênica
Descobri que muitos estudos usam a concentração de mRNA como um "proxy" para a atividade da proteína porque deve haver correlação entre os níveis de mRNA e os níveis de expressão de proteínas. Como a atividade da proteína é quantificada? Qual quantidade é usada? Quais são os níveis de expressão de proteínas?
Estou fazendo algumas análises estatísticas de dados usando este conjunto de dados . Gostaria de entender por que eles têm se interessado em medir a concentração de mRNA após a irradiação gama das células (e em geral, parece-me que biólogos em muitos experimentos estão interessados nisso). Encontrei neste site aquela discussão sobre a correlação entre a concentração de mRNA (então o nível de expressão do gene) e o "nível de expressão da proteína". Portanto, eu queria saber o que é o último. Além disso, no artigo relacionado ao meu conjunto de dados está escrito
Muito poucos genes de reparo de DNA exibiram expressão diferencial significativa em P. furiosus após irradiação gama.
E depois
os dados que relatamos aqui sugerem que as proteínas de reparo de DNA em P. furiosus e várias outras arqueas são expressas constitutivamente e que podem estar presentes na célula em um nível suficiente para manter a integridade do material genético da célula.
Então, juntando o que os cientistas concluem com o que MattDMo respondeu para mim e o que é discutido aqui , acho que posso concluir que "nível de expressão de proteína" é uma medida da quantidade de proteína realmente traduzida do mRNA, que então (em neste caso) atuará efetivamente para reparar o DNA. Portanto, "nível de expressão de proteína", bem como "atividade de proteína", indicam as proteínas traduzidas do mRNA e que atuarão ativamente no reparo de danos ao DNA (neste caso, estamos falando de proteínas de reparo de DNA e genes de reparo de DNA).
Devo dizer que não sei bem o que significa "proteínas de reparo de DNA são expressas constitutivamente", mas acho que é que as proteínas de reparo de DNA já foram traduzidas do mRNA e, portanto, estão "presentes na célula em um nível suficiente para manter a integridade do material genético da célula ”(como dizem logo em seguida).
Tudo isso faz sentido para mim se eu pensar sobre meu primeiro objetivo, que era entender a razão de medir a concentração de mRNA. Estamos interessados nisso porque deveria haver correlação entre a concentração de mRNA (nível de expressão do gene) e as proteínas realmente traduzidas do mRNA daquele gene específico, a fim de saber que tipo de proteínas atuam efetivamente nos processos de reparo do DNA (neste caso )
Eu me pergunto se toda essa interpretação está correta ...
Respostas
O que é nível de expressão de proteína?
Este era o título original da postagem, que eu mesmo editei porque considero a resposta trivial, mas a pergunta mais substancial. Para lidar com o trivial primeiro:
'Nível' não é uma unidade científica e só pode ser usado sem ambigüidades como um termo científico em seu sentido inglês em relação a líquidos, por exemplo, “O nível de mercúrio no termômetro caiu.”, “A terra está 10 metros acima do mar nível."
É usado por algumas pessoas na fala ou na escrita informal para indicar uma quantificação indefinida e, devido à sua própria ambigüidade, deve ser fortemente desencorajado na comunicação científica.
Portanto, nem eu nem ninguém pode dizer o que é "nível de expressão de proteína" sem descobrir o que o originador da frase pretendia (se é que ele sabia) em qualquer instância individual: quantidade ou concentração de proteína, ou a taxa de sua síntese.
Quantificação
Vamos considerar alguns aspectos gerais de uma molécula celular que pode requerer quantificação : Quantidade, Taxa de Síntese, Taxa de Degradação e, quando relevante, Atividade Biológica.
A quantificação de moléculas em sua forma mais básica é o número de espécies, ou, mais praticamente, sua massa total (gramas), quando possível relacionada à sua massa molecular (ou seja, moles). A taxa de sua síntese ou degradação é expressa em termos da mudança de sua quantidade em unidade de tempo.
Para comparar diferentes sistemas, é necessária uma referência para a quantificação. Isso pode ser por unidade de volume, por célula, por g de proteína celular, por g de DNA, etc. (No entanto, para comparação de sistemas semelhantes ou dentro de um sistema, a referência é frequentemente omitida.)
A atividade biológica das moléculas só tem significado se as moléculas forem, de fato, biologicamente ativas (por exemplo, enzimas). É expresso em unidades relacionadas a essa atividade.
Exemplos de quantificação para proteínas
As unidades reais usadas na quantificação são determinadas por como alguém é capaz de medir o parâmetro de interesse.
Quantidade relativa de proteína: você pode detectar uma proteína pela intensidade da coloração de uma banda em um gel ou pela extensão da precipitação usando um anticorpo correspondente. Estes teriam que ser calibrados em relação aos padrões, a fim de converter medições experimentais brutas em proteína g ou mol. As unidades típicas de quantidade relativa são g / g de proteína total, g / g de DNA.
Taxa de síntese ou degradação de proteínas. Você pode detectar a síntese de proteínas pela taxa de incorporação de aminoácidos radioativos em proteínas não radioativas e pela taxa de degradação pela liberação de aminoácidos radioativos de proteínas pré-marcadas. As unidades típicas de síntese seriam mg de aminoácidos incorporados por minuto por mg de proteína total. (Isso pode ser convertido em moléculas sintetizadas ou degradadas por minuto, se necessário.)
'Atividade proteica' : O uso deste termo não é recomendado. Em termos químicos, a atividade de uma molécula é uma medida de sua “concentração efetiva” , e em relação às proteínas seria apenas preocupação dos biofísicos e afins. Outros biólogos associam o termo à atividade biológica que uma proteína, como uma enzima, pode ter, mas, como muitas proteínas são estruturais, o termo "atividade" não pode ser aplicado a proteínas em geral. Onde for de interesse, seria quantificado em termos da natureza da atividade, por exemplo, uma enzima é quantificada em unidades relacionadas à quantidade de substrato convertido em produto em um determinado tempo.
Quantificação da expressão gênica usando microarrays de oligonucleotídeo
Os dois extremos na quantificação da expressão gênica são o estudo detalhado da expressão de um gene particular que codifica uma proteína para a qual informações e ferramentas estão disponíveis; e estudo geral da expressão de muitos genes usando métodos modernos que permitem o estudo de muitas moléculas simultaneamente. Tais métodos incluem espectrometria de massa (para metabólitos pequenos), eletroforese em gel bidimensional (para proteínas) e microarrays ou RNAseq (para mRNA). Em geral, no último caso, seria possível examinar o efeito de algum agente ou condição em todo o espectro de expressão gênica.
Vamos examinar a tecnologia de microarray, pois essa é a principal preocupação do pôster.
A tecnologia de microarray mede as quantidades relativas de mRNA.
A metodologia envolve a amplificação de uma mistura de espécies de mRNA por transcrição reversa para cDNAs, que são marcados com um corante fluorescente. O cDNA é hibridizado com oligonucleotídeos imobilizados com base nas sequências dos genes no organismo, e a força do sinal de fluorescência é considerada proporcional à quantidade de espécies de mRNA individuais na amostra. No entanto, os dados fornecidos ao usuário são a intensidade relativa da imagem dentro do experimento, ao invés de unidades que permitem calcular a quantidade real de mRNA.
Como essas quantidades relativas de mRNA se relacionam com a expressão gênica?
As quantidades relativas de mRNA são uma medida relativa da taxa de síntese de proteínas (3 em dig.), Se se assumir que a taxa de síntese de cada proteína é similarmente proporcional à quantidade de seu mRNA (a em dig.) Que seria limitante. Esta é uma suposição razoável na maioria dos casos, dado que o mRNA é degradado mais rapidamente do que a proteína. (Eles não são uma medida da quantidade de proteína - b na digestão.)
As quantidades relativas de mRNA não podem ser tomadas como uma medida da taxa de transcrição de um mRNA de seu gene (1 em dig.) Devido ao efeito relativamente maior da degradação de mRNA (2 em dig.) Na concentração de estado estacionário de mRNAs , e o fato de que diferentes mRNAs têm diferentes meias-vidas.
Pós-escrito para o pôster
Tentei tornar esta resposta geral, para ser útil a mais pessoas. Como a autora não é uma bióloga, ela ainda pode ter dificuldade em compreender os antecedentes dos experimentos biológicos que geraram os dados que está analisando.
O sistema biológico de interesse é a expressão gênica, que engloba toda a série de eventos desde a transcrição de genes para mRNA e sua tradução em proteína. O pano de fundo para isso é que existem alguns genes que são (quase) sempre expressos, independentemente das circunstâncias fisiológicas, porque são necessários para manter a estrutura e as funções cotidianas da célula. Isto é denominado expressão constitutiva , sendo exemplos a expressão dos genes para actinas do citoesqueleto ou proteínas ribossomais. Outros genes são expressos ('ligados') apenas quando necessário (e podem ser denominados induzíveis ). A questão aqui parece ser se os genes para as enzimas envolvidas no reparo do DNA são expressos o tempo todo (constitutivamente) para lidar com o 'desgaste' normal do DNA, ou se sua expressão ocorre apenas em resposta a algum insulto conhecido a danificar o DNA, como a irradiação gama.
Como mencionei, como cientista experimental, uma abordagem que pode ser adotada aqui é observar a expressão de uma ou duas proteínas bem caracterizadas que são conhecidas por estarem envolvidas no reparo do DNA. No entanto, pode haver proteínas envolvidas neste processo que você não conhece, portanto, os métodos modernos de olhar para a expressão de todos os genes em um organismo (se a sequência de DNA for conhecida) - microarrays de oligonucleotídeos ou, melhor, RNASeq. Esses métodos medem quantidades relativas de mRNA em uma célula. Este não é um proxy para a quantidade de proteína ou taxa de sua síntese (o termo 'atividade da proteína' não tem sentido e não é e não deve ser usado), é o que é , mas também é um reflexo da expressão dos genes que codificam os mRNAs. Sem expressão, sem mRNA.
Você pode pensar nas abordagens de microarray e RNASeq como expedições de pesca. Se você encontrar mRNAs que estão presentes apenas após a célula receber um estímulo ou um insulto, a expressão do mRNA ocorreu (sejam ou não as quantidades diretamente proporcionais à taxa de síntese). Se o mRNA for sintetizado, você pode assumir que é traduzido na proteína que codifica. No caso da irradiação gama, você pode assumir que qualquer mRNA que mostra um grande aumento na quantidade codifica uma proteína envolvida na proteção da célula da radiação. Isso será de interesse científico, especialmente se não for o que se esperava.