Kontamination der Genomassemblierung
Ich hatte eine Frage an die Community.
Ich habe ein Genom einer neuen Art, die über das 150 pb Illumina Paired End sequenziert wurde.
Um die Qualität der Assemblierung zu überprüfen, habe ich das verwendet BUSCO pipeline, mit dem ich nach 99% der BUSCO-Gene (nicht dupliziertes Gen) suchen kann, die in einem Taxon im Genom meiner Spezies vorhanden sind.
Weltweit vermisse ich nur 18%die BUSCO-Gene, was bedeutet, dass die Assemblierung nicht schlecht ist.
Wenn ich nun die G + C% und die Abdeckung aller Gerüste, die BUSCO-Gene enthalten (also a priori nicht kontaminierend), aufzeichne, sollte ich eine ziemlich homogene Wolke finden.
Stattdessen habe ich zwei verschiedene Abdeckungsprofile (unten rot und blau vermerkt):
Ich dachte dann, dass das Sequenzierungsprofil mit geringer Abdeckung um das Vierfache eine eukaryotische Verunreinigung wie ein Akarier sein könnte, aber wenn ich die auf diesen Gerüsten mit geringer Abdeckung vorhandenen BUSCOs sprenge, bekomme ich Treffer, die dem Genom meiner Spezies sehr nahe kommen ...
Hat jemand eine Idee was das sind?
Hier ist eine Ausgabe von, bei der contigsTable.csvdie beiden ersten Reihen Gerüste mit geringer Abdeckung in der Figur sind und zwei letzte Gerüste mit hoher Abdeckung in der Figur sind
FRC-Ausgabe
Deckungsverteilung
Hier ist eine Ikarus-Zusammenfassung der Versammlung:
Assembly
# contigs (>= 0 bp) 1038631
# contigs (>= 1000 bp) 120132
# contigs (>= 5000 bp) 22245
# contigs (>= 10000 bp) 9986
# contigs (>= 25000 bp) 1322
# contigs (>= 50000 bp) 97
Total length (>= 0 bp) 655530043
Total length (>= 1000 bp) 451497861
Total length (>= 5000 bp) 260894112
Total length (>= 10000 bp) 174183054
Total length (>= 25000 bp) 45006012
Total length (>= 50000 bp) 5956145
# contigs 214542
Largest contig 120620
Total length 519138286
GC (%) 32.94
N50 5062
N75 1624
L50 21982
L75 71030
# N's per 100 kbp 22.28
Hier ist auch die BUSCO-Zusammenfassung:
2544 Complete BUSCOs (C)
2312 Complete and single-copy BUSCOs (S)
232 Complete and duplicated BUSCOs (D)
1060 Fragmented BUSCOs (F)
811 Missing BUSCOs (M)
4415 Total BUSCO groups searched
C:57.7%[S:52.4%,D:5.3%],F:24.0%,M:18.3%,n:4415
BEARBEITEN
Ich habe die Fastq-Sequenzen mit einem anderen Aligner (MEGAHIT) ausgeführt, um festzustellen, ob dies nicht auf ein Assembly-Problem zurückzuführen ist, und ich habe die gleiche Profilabdeckung erhalten, siehe hier:
Antworten
Dies könnte organismusspezifisch sein. Wir haben bisher nicht viele Informationen, daher würde ich noch ein paar Dinge überprüfen:
Führen Sie so etwas wie FRC_align aus . Überprüfen Sie, ob zwischen Regionen, die als verdächtig gekennzeichnet sind, und Ihrem Abdeckungsdiagramm ein eindeutiges Signal vorhanden ist.
Ist es ein Eukaryot? Pflanze? Überprüfen Sie, wo sich Mitchondrien und Chloroplasten auf dem Grundstück befinden. Sie haben andere GC- / Abdeckungssignale als der Rest Ihrer Baugruppe, was in Ordnung ist und sogar erwartet wird.
Besorgt über Kontamination? Führen Sie kraken2 für Ihre Rohdaten aus und sehen Sie, was Sie dort erhalten.
Führen Sie RepeatMasker aus und prüfen Sie, ob sich wiederholende Bereiche zu dem angezeigten Effekt beitragen.
Schließlich haben Sie wahrscheinlich einen gewissen Effekt durch Ploidie, es sei denn, Ihre Probe weist eine geringe Heterozygotie, Haploide oder Inzucht auf. Es gibt zahlreiche Möglichkeiten, dies zu überprüfen. Ein Selbst-Selbst- Punktdiagramm mit MUMmer und aussehenden Abdeckungshistogrammen sind ein guter Anfang. Die Idee ist, dass Sie zwei Spitzen sehen sollten (nehmen wir diploid an). Eine für die gespaltenen Haplotigs und eine für die zusammengebrochenen.
Ich habe die GC-Verteilung von 45 Genomen in Ihrer Bestellung überprüft. Es ist irgendwie überall, aber es gibt einige bimodale:
Wie sieht GC vs Length aus? Hier ist das aus den 45 oben genannten Genomen:
Das ist in der Tat rätselhaft. Meine beste Vermutung wäre Kontamination, selbst wenn sie einige der BUSCOs tragen. Ich führe alle De-novo-Genome über Blobtools aus , wodurch ein ähnliches Diagramm wie das manuell erstellte erstellt wird, aber auch taxonomische Anmerkungen hinzugefügt werden . Es kann so aussehen:
Wie hoch ist der Anteil des Genoms, der nur eine geringe Abdeckung aufweist? Hat es eine signifikante Spanne? Ich sehe fast immer ein paar winzige Contigs mit geringer Abdeckung in De-novo-Assemblies, aber sie machen normalerweise einen sehr kleinen Teil des Genoms aus.
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Noch ein Gedanke, sind Sie sicher, dass Sie keine tetraploide Art haben? Die beiden Abdeckungsspitzen entsprechen 8x und 32x, oder? Einer ist 1/4 des anderen. Wir haben einige Tools entwickelt, um diese Art von Datenproblemen zu untersuchen .
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Nur noch ein paar Kommentare. Abdeckungsunterschiede können verschiedene Gründe haben, aber alle Sequenzierungsverzerrungen würden eine Verschiebung der Verteilung verursachen, weshalb die offensichtliche Bimodalität Ihrer Abdeckung (deutlicher aus den beiden 2D-Darstellungen ersichtlich) zwei unterschiedliche Quellen nahe legt. Im Allgemeinen kann dies auf verschiedene Ploidie-Niveaus oder Kontaminationen durch Bakterien, Endosymbionten oder sogar andere Spezies zurückzuführen sein, die in die DNA-Isolierung geraten. Jetzt, da Polyploidie ausgeschlossen ist, läuft es auf Kontamination hinaus, und um herauszufinden, um welche Kontamination es sich handelt, empfehle ich das Werkzeug, das mir oben gefallen hat.