RT-PCR: यह नहीं देखना कि यह mRNA अभिव्यक्ति के स्तर को कैसे माप सकता है

Question

मेरी समझ से, आरटी-पीसीआर में हम एमआरएनए अणु के साथ शुरू करते हैं, एक सीडीएनए प्रतिलिपि बनाने के लिए एंजाइम रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग करते हैं (इसलिए डबल-स्ट्रैंडेड एमआरएनए / सीडीएनए हाइब्रिड बना रहे हैं), एमआरएनए को नीचा दिखाते हैं और अंत में एक पूरक स्ट्रैंड बनाते हैं। डीएनए पोलीमरेज़ के साथ सीडीएनए। यदि हम अंततः डीएनए बना रहे हैं और इसे प्रत्येक चक्र पर दोहराया जा रहा है, तो हम अपने नमूने में mRNA की मूल मात्रा को कैसे घटा सकते हैं? ऐसा लगता है कि हमें इसे किसी अन्य विधि के साथ संयोजित करने की आवश्यकता होगी, लेकिन बहुत सारे स्रोत जो मैं देख रहा हूं, इसका मतलब है कि आरटी-पीसीआर अकेले एक नमूने में एमआरएनए की मात्रा को "यों" करने के लिए पर्याप्त है। इस पर कोई भी विचार स्वागत योग्य है

Answer 1

शब्दावली का भ्रम हो सकता है। वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर है, जिसे कभी-कभी आरटी-पीसीआर कहा जा सकता है। रिवर्स-ट्रांसक्रिपटेस पीसीआर भी है, जिसे भ्रामक रूप से आरटी-पीसीआर भी कहा जाता है। भ्रम को कम करने की कोशिश करने के लिए, वास्तविक समय की मात्रात्मक पीसीआर को RT-qPCR या qPCR भी कहा जाता है।

आप अपने प्रश्न में जो वर्णन करते हैं वह पीसीआर का रिवर्स-ट्रांसक्रिपटेस प्रकार है। इसका उपयोग प्रवर्धन के लिए किया जाता है, न कि परिमाणीकरण, आरंभिक सामग्री के लिए।

दूसरी ओर, QPCR या मात्रात्मक पीसीआर, प्रवर्धित जीन उत्पाद की मात्रा को मापने के लिए फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग करता है। मापित प्रतिदीप्ति की दी गई मात्रा के लिए मानक प्रत्येक पीसीआर चक्र में समय के साथ आपको कितनी आनुवांशिक सामग्री की उम्मीद करनी चाहिए, यह आधारभूत माप प्रदान करता है। समय के साथ अपने स्वयं के नमूने की प्रतिदीप्ति को मापना, और मानक के खिलाफ तुलना करना, आपको शुरू में आपके द्वारा शुरू किए गए एक अनुमान देता है।

Answer 2

मैं वास्तविक समय (मात्रात्मक) और रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन (आरटी) पीसीआर के बीच भ्रम के बारे में पिछले उत्तर पर विस्तार से बताना चाहता था। RT-qPCR वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर को संदर्भित करता है, लेकिन कुछ संगठन नामकरण rRT-PCR (रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन रियल-टाइम पीसीआर, मेरा अनुमान है) का उपयोग करने के बजाय, किसी भी संदर्भ से मात्रात्मकता के संदर्भ में खंडन करते हैं (क्योंकि यह वास्तव में केवल अर्ध-मात्रात्मक है)। या तो मामले में, यह तकनीक सैद्धांतिक रूप से उपयुक्त परख डिजाइन और मानकों का उपयोग करते हुए mRNA प्रतियों के परिमाणीकरण में सक्षम है।

सामान्य सिद्धांत यह है कि, सीडीएनए के आरएनए से रिवर्स ट्रांसकोड होने के बाद, यह एक सामान्य पीसीआर प्रतिक्रिया के समान प्रवर्धित होता है। इसे मास्टर प्रतिक्रिया के साथ एक एकल प्रतिक्रिया में पूरा किया जा सकता है, जिसमें रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और qPCR अभिकर्मक दोनों शामिल हैं, या दो अलग-अलग प्रतिक्रियाओं में, पहले आरटी पहले प्रदर्शन करके, और फिर परिणामी cDNA पर एक मानक qPCR। सभी एक विधि में समय पर कम अभिकर्मकों और कम हाथों की आवश्यकता होती है, लेकिन एक ही समय में दोनों प्रतिक्रियाओं को अनुकूलित करना मुश्किल हो सकता है।

यहाँ qPCR परख डिजाइन पर एक अच्छा प्राइमर है । जैसा कि पिछले उत्तर में कहा गया है, परिमाणीकरण कुछ प्रतिदीप्ति माप से आता है जो कि प्रवर्धन उत्पाद की मात्रा से संबंधित है। एक अनुकूलित प्रतिक्रिया में, एम्पलीकोन्स की संख्या प्रत्येक चक्र के साथ दोगुनी होनी चाहिए, यह निर्दिष्ट करने के लिए कि प्रत्येक प्रतिक्रिया अच्छी तरह से एक प्रतिदीप्ति सीमा तक पहुंचने से पहले कितने चक्र होते हैं। सैबरग्रीन जैसी अंतर्वर्धित रंजक कुल डीएनए को निर्धारित करती है, जबकि फ्लोरोसेंट जांच आपके जीन के हित के लिए अधिक विशिष्ट है। क्योंकि यह केवल अर्ध-मात्रात्मक है, ज्ञात एकाग्रता का एक मानक कमजोर पड़ने की श्रृंखला प्रत्येक प्लेट पर शामिल है और इसका उपयोग परिमाणीकरण के लिए किया जाता है। मानकों को समान सामग्री और अनुक्रम होना चाहिए क्योंकि आपके जीन ऑफ इंटरेस्ट (डीएनए या आरएनए) और सांद्रता की एक सीमा में पतला होना चाहिए जो आपके प्रयोगात्मक नमूनों में एकाग्रता को शामिल करेगा। आपको अपने मानकों के विघटन की संभावना के बारे में भी सावधान रहने की आवश्यकता है, क्योंकि आपके परिमाण की गुणवत्ता पूरी तरह से आपके मानकों की गुणवत्ता पर निर्भर करती है।

एक वैकल्पिक दृष्टिकोण कुछ संदर्भ जीन के सापेक्ष ब्याज की जीन को निर्धारित करना है जो प्रयोगात्मक नमूने की परवाह किए बिना समान स्तर पर व्यक्त की जाती है। यह विधि (कभी - कभी डेल्टा-डेल्टा सीटी विधि कहलाती है ) मानक वक्र को चलाने की आवश्यकता को समाप्त करती है, लेकिन प्राइमरों के साथ एक स्थिर संदर्भ जीन की पहचान करने के अलावा अतिरिक्त प्रतिक्रियाओं या बहुसंकेतन की आवश्यकता होती है, और संभवतः जांच करता है जो उसी थर्मामीटरिंग शर्तों के तहत काम करेगा। आपकी रुचि का जीन।

एक तीसरा विकल्प डिजिटल पीसीआर (डीपीसीआर) के माध्यम से पूर्ण परिमाणीकरण है। सामान्य रूप से qPCR के साथ एक मुद्दा यह है कि डुप्लिकेट या ट्रिपलेट में नमूने चलाते समय, लगभग 3 गुना से छोटे मात्रा में अंतरों को आत्मविश्वास से हल करना मुश्किल हो सकता है। पूर्ण परिमाण दर्ज करें। dPCR प्रतिक्रिया को हज़ारों नैनो-लीटर आकार के डिब्बों में विभाजित करके काम करता है, जैसे कि प्रत्येक डिब्बे में आपके जीन की ब्याज की वास्तविक प्रति शामिल हो सकती है या नहीं। प्रतिदीप्ति का उपयोग केवल प्रतिक्रिया के अंत में यह निर्धारित करने के लिए किया जाता है कि क्या प्रत्येक कंपार्टमेंट को प्रवर्धित किया गया है या नहीं (इसलिए डिजिटल, प्रत्येक कम्पार्टमेंट 1 या 0 है)। परिमाणीकरण की गणना ऋणात्मक डिब्बों के सकारात्मक के अनुपात को निर्धारित करके और असतत संभाव्यता विकारों के लिए एक पॉइसन वितरण की तुलना करके की जाती है। यह qPCR की तुलना में बहुत महीन संकल्प हो सकता है, माना जाता है कि सांद्रता में 1.2-गुना अंतर का विश्वसनीय रूप से पता लगाने में सक्षम है, व्यापार-बंद के साथ यह उस सीमा के ऊपर और नीचे के पास मात्रात्मक अनुमानों में कम आत्मविश्वास के साथ कम गतिशील रेंज है। इसके अलावा पूरी प्रणाली आमतौर पर हर स्तर (उपकरण, अभिकर्मकों और उपभोग्य सामग्रियों) के बारे में बहुत अधिक महंगी है। लेकिन अधिकांश जीन अभिव्यक्ति के साथ, आपको वास्तव में खुद से पूछने की जरूरत है कि क्या ट्रांसक्रिप्ट स्तर में 1.2-गुना परिवर्तन आपके जैविक प्रणाली में भी सार्थक होने वाला है।