Implications des spectres d'excitation
Les spectres d'excitation de fluorescence montrent l'évolution de l'intensité de fluorescence en fonction de la longueur d'onde de la lumière d'excitation.
Je m'intéresse à certaines implications physiques de ce qui précède.
Cela signifie-t-il qu'à la longueur d'onde maximale d'excitation, la plupart des molécules sont excitées? Ou émettent-ils simplement plus de photons par molécule par unité de temps?
De plus, si le premier est correct, y a-t-il une relation entre le pourcentage de molécules excitées et les spectres d'excitation?
Réponses
Les spectres d'excitation de fluorescence montrent l'évolution de l'intensité de fluorescence en fonction de la longueur d'onde de la lumière d'excitation. Cela signifie-t-il qu'à la longueur d'onde maximale d'excitation, la plupart des molécules sont excitées? Ou émettent-ils simplement plus de photons par molécule par unité de temps?
Vous devez comprendre comment le spectre d'excitation est collecté. Il faut connaître (ou au moins avoir une estimation) du maximum d'émission d'une molécule donnée. Par exemple, si nous avons de la quinine, je dois savoir qu'elle émet de la lumière bleue et que la longueur d'onde maximale d'émission est d'environ 450 nm.
Nous allons maintenant fixer la longueur d'onde d'émission à 450 nm et balayer toute la gamme UV-VIS pour l'excitation. Disons que nous exciterions la quinine avec 200 à 700 nm. Une longueur d'onde à la fois, et comptez combien de photons correspondant à 450 nm ont été émis. Ce graphique s'appelle le spectre d'excitation.
Un spectre d'excitation vous indique essentiellement quelle longueur d'onde (d'un instrument donné) va montrer l'intensité la plus élevée. J'ai mis l'accent sur "un instrument donné" car un spectre d'excitation doit être corrigé pour l'intensité de la source lumineuse. Cela variera d'un instrument à l'autre. Personne ne le corrige car c'est une procédure longue car malheureusement, la normalisation ne peut pas la corriger.
Quoi qu'il en soit, un spectre d'excitation corrigé doit correspondre à la forme du spectre d'absorption à condition qu'il n'y ait qu'un seul fluorophore dans la molécule .
J'ai voulu relier le spectre d'excitation à un spectre d'absorption car nous pouvons maintenant relier l'absorbance molaire à l'excitation. Considérez l'absorbance molaire comme une mesure de la probabilité d'excitation. Plus la valeur de l'absorbance molaire est élevée, plus de molécules absorberont la lumière et donc plus en émettront. Votre première interprétation est donc correcte. C'est un comportement collectif de toutes les molécules qui sont illuminées dans la cuvette.
Rappelez-vous également que l'émission d'excitation est normalement une excitation d'un photon et une émission d'un photon dans la majorité des cas jusqu'à et à moins que vous n'utilisiez des lasers sophistiqués. Vous ne pouvez donc pas avoir un photon à l'intérieur et plusieurs photons à l'extérieur dans les cas courants. Dans des cas plus rares, vous pouvez en effet avoir deux photons pour l'excitation et un photon pour la sortie. Vous avez à nouveau besoin de lasers.
De bons livres ont été écrits pour expliquer toutes les implications de la spectroscopie par fluorescence. Il n'y a pas de réponse universelle en raison des complications de l'expérience. En général, il existe des spectres atomiques et des spectres moléculaires.
- Les spectres atomiques ont tendance à donner des spectres de raies.
- Pour les molécules cependant, l'énergie de liaison de l'électron dépend non seulement de l'énergie électronique mais aussi de l'état vibrationnel de la molécule. Ce couplage crée un micro-état et donc les molécules ont tendance à donner de larges pics.
Il y a aussi le Stokes Shift qui indique que le photon excitant doit être d'une plus grande énergie que le photon émis. C'est généralement vrai, mais il y a aussi un rayonnement de résonance et un rayonnement anti-Stokes.
Étant donné:
Les spectres d'excitation de fluorescence montrent l'évolution de l'intensité de fluorescence en fonction de la longueur d'onde de la lumière d'excitation.
Cela signifie-t-il qu'à la longueur d'onde maximale d'excitation, la plupart des molécules sont excitées?
Peut-être...
Normalement, lorsque vous essayez de mesurer la sensibilité d'excitation, vous normalisez le nombre de photons d'excitation. Considérez-le comme le nombre de photons d'émission émis par photon d'excitation par rapport à l'énergie du photon d'excitation. (Ce sera normalement considéré comme inférieur à 1). Cependant, un spectre d'excitation réel n'a pas besoin d'avoir la même intensité de photons à chaque énergie. Ainsi, beaucoup de photons d'excitation à une énergie non optimale pourraient produire plus de photons d'excitation que l'énergie optimale à une intensité plus faible.
Ou émettent-ils simplement plus de photons par molécule par unité de temps?
En général, un photon d'excitation crée un état excité qui peut se désintégrer par l'émission d'un photon.
Il existe bien sûr des lasers où les atomes ou molécules sont pompés dans un état excité puis un photon peut stimuler les émissions multiples.
De plus, si le premier est correct, y a-t-il une relation entre le pourcentage de molécules excitées et les spectres d'excitation?
Le rendement quantique fluorescent est le nombre de photons d'excitation émis par état excité.