RT-PCR : mRNA 발현 수준을 측정하는 방법을 알지 못함
내 이해에서 RT-PCR에서 우리는 mRNA 분자로 시작하고 효소 역전사 효소를 사용하여 cDNA 사본을 만들고 (따라서 이중 가닥 mRNA / cDNA 하이브리드 생성) mRNA를 분해하고 마지막으로 보완 가닥을 만듭니다. DNA 중합 효소를 가진 cDNA. 우리가 궁극적으로 DNA를 생성하고 각주기에서 복제된다면 샘플에서 mRNA의 원래 양을 어떻게 추론 할 수 있을까요? 다른 방법과 결합해야 할 것 같지만 제가보고있는 많은 출처에서 RT-PCR만으로도 샘플의 mRNA 양을 "정량화"하기에 충분하다는 것을 암시하는 것 같습니다. 이에 대한 모든 의견을 환영합니다
답변
용어가 혼동 될 수 있습니다. RT-PCR이라고도하는 실시간 정량 PCR이 있습니다. RT-PCR이라고도하는 역전사 효소 PCR도 있습니다. 혼란을 줄이기 위해 실시간 정량 PCR을 RT-qPCR 또는 qPCR이라고도합니다.
귀하의 질문에서 설명하는 것은 PCR의 역전사 효소 유형입니다. 이것은 시작 물질의 정량화가 아닌 증폭에 사용됩니다.
반면에 QPCR 또는 정량적 PCR은 형광 염료를 사용하여 증폭 된 유전자 산물의 양을 측정합니다. 표준은 주어진 양의 측정 된 형광에 대해 각 PCR주기에서 시간이 지남에 따라 얼마나 많은 유전 물질을 볼 수 있는지에 대한 기준 측정 값을 제공합니다. 시간이 지남에 따라 자체 샘플의 형광을 측정하고 표준과 비교하면 처음에 시작한 것의 추정치를 얻을 수 있습니다.
실시간 (정적) PCR과 역전사 (RT) PCR의 혼동에 대한 이전 답변에 대해 자세히 설명하고 싶었습니다. RT-qPCR은 실시간 정량 PCR을 의미하지만, 일부 조직에서는 rRT-PCR (역전사 실시간 PCR, 역전사 실시간 PCR)이라는 명명법을 사용하는 대신 정량화에 대한 참조를 자제합니다 (실제로는 반 정량적이므로). 두 경우 모두,이 기술은 이론적으로 적절한 분석 설계 및 표준을 사용하여 mRNA 사본을 정량화 할 수 있습니다.
일반적인 원리는 cDNA가 RNA에서 역전사 된 후 정상적인 PCR 반응과 유사하게 증폭된다는 것입니다. 이는 역전사 및 qPCR 시약을 모두 포함하는 마스터 믹스를 사용한 단일 반응으로 수행하거나, 먼저 RT를 먼저 수행 한 다음 생성 된 cDNA에서 표준 qPCR을 수행하여 두 개의 개별 반응으로 수행 할 수 있습니다. 올인원 방법은 시약과 시간이 적게 필요하지만 동시에 두 반응을 최적화하는 것은 어려울 수 있습니다.
다음은 qPCR 분석 설계 에 대한 좋은 입문서입니다 . 이전 답변에서 언급했듯이 정량화는 존재하는 증폭 산물의 양과 관련된 형광 측정에서 비롯됩니다. 최적화 된 반응에서 앰플 리콘의 수는 각주기마다 두 배가되어야하며, 각 반응에 의해 지정된 형광 임계 값에 도달하기 전에 발생하는주기 수에 따라 정량화 할 수 있습니다. SyberGreen과 같은 삽입 염료는 존재하는 총 DNA를 정량화하는 반면 형광 프로브 는 관심있는 유전자에 더 구체적입니다. 반 정량적이기 때문에 알려진 농도의 표준 희석 시리즈가 각 플레이트에 포함되어 정량화에 사용됩니다. 표준 물질은 관심 유전자 (DNA 또는 RNA)와 동일한 물질 및 서열이어야하며 실험 샘플의 농도를 포함 할 수있는 농도 범위로 희석해야합니다. 또한 정량화의 품질이 표준의 품질에 전적으로 의존하기 때문에 표준의 퇴화 가능성에 대해주의해야합니다.
대안적인 접근 방식은 실험 샘플에 관계없이 동일한 수준에서 구성 적으로 발현되는 일부 참조 유전자와 관련된 관심 유전자를 정량화하는 것입니다. 이 방법 (때때로 델타-델타 Ct 방법 이라고도 함 )은 표준 곡선을 실행할 필요가 없지만, 프라이머와 동일한 열 순환 조건에서 작동 할 수있는 프로브로 안정적인 참조 유전자를 식별하는 것 외에도 추가 반응 또는 다중화가 필요합니다. 관심있는 유전자.
세 번째 옵션은 디지털 PCR (dPCR)을 통한 절대 정량화 입니다. 일반적으로 qPCR의 한 가지 문제는 샘플을 중복 또는 삼중으로 실행하더라도 약 3 배 미만의 정량 차이를 확실하게 해결하기 어려울 수 있다는 것입니다. 절대 정량화를 입력하십시오. dPCR은 반응을 수만 나노 리터 크기의 구획으로 분할하여 각 구획에 관심 유전자의 실제 사본을 포함 할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있습니다. 형광은 각 구획이 증폭되었는지 여부를 결정하기 위해 반응이 끝날 때만 사용됩니다 (따라서 디지털, 각 구획은 1 또는 0입니다). 정량화는 양의 구획과 음의 구획의 비율을 결정하고 불연속 확률 분포에 대한 포아송 분포와 비교하여 계산됩니다. 농도의 1.2 배 차이를 안정적으로 감지 할 수있는 qPCR보다 훨씬 더 미세한 분해능을 가질 수 있으며, 해당 범위의 상단 및 하단 근처에서 정량화 추정치에 대한 신뢰도가 감소하면서 동적 범위가 적다는 단점이 있습니다. 또한 전체 시스템은 일반적으로 거의 모든 수준 (장비, 시약 및 소모품)에서 훨씬 더 비쌉니다. 그러나 대부분의 유전자 발현 분석에서는 전 사체 수준의 1.2 배 변화가 생물학적 시스템에서 의미가 있는지 스스로에게 물어볼 필요가 있습니다.