RT-PCR: mRNA ekspresyon seviyelerini nasıl ölçebileceğini göremiyorum
Anladığım kadarıyla, RT-PCR'de bir mRNA molekülüyle başlıyoruz, bir cDNA kopyası oluşturmak için enzim ters transkriptazı kullanıyoruz (bu nedenle çift sarmallı bir mRNA / cDNA hibriti oluşturuyoruz), mRNA'yı bozuyoruz ve son olarak DNA polimeraz içeren cDNA. Nihayetinde DNA yaratıyorsak ve her döngüde kopyalanacaksa, örneğimizdeki orijinal mRNA miktarını nasıl çıkarabiliriz? Görünüşe göre onu başka bir yöntemle birleştirmemiz gerekiyor, ancak gördüğüm birçok kaynak, tek başına RT-PCR'nin bir örnekteki mRNA miktarını "ölçmek" için yeterli olduğunu ima ediyor gibi görünüyor. Bununla ilgili herhangi bir düşünceye açığız
Yanıtlar
Bir terminoloji karışıklığı olabilir. Bazen RT-PCR olarak da adlandırılabilen gerçek zamanlı kantitatif PCR vardır. Ayrıca kafa karıştırıcı bir şekilde RT-PCR olarak da adlandırılan ters transkriptaz PCR vardır. Karışıklığı azaltmaya çalışmak için gerçek zamanlı nicel PCR'ye RT-qPCR veya qPCR de denir.
Sorunuzda tanımladığınız şey, ters transkriptaz tipi PCR'dir. Bu, başlangıç materyalinin miktarının belirlenmesi için değil amplifikasyonu için kullanılır.
Öte yandan QPCR veya kantitatif PCR, büyütülmüş gen ürününün miktarını ölçmek için floresan boyalar kullanır. Standartlar, belirli bir ölçülen floresan miktarı için her PCR döngüsünde zaman içinde ne kadar genetik materyal görmeyi beklemeniz gerektiğine dair temel bir ölçüm sağlar. Kendi örneğinizin zaman içindeki floresansını ölçmek ve bunu standartla karşılaştırmak, başlangıçta neyle başladığınız hakkında size bir tahmin verir.
Sadece gerçek zamanlı (kantitatif) ve ters transkripsiyon (RT) PCR arasındaki karışıklığa ilişkin önceki cevabı detaylandırmak istedim. RT-qPCR, gerçek zamanlı kantitatif PCR'yi ifade eder, ancak bazı kuruluşlar, rRT-PCR (ters transkripsiyon gerçek zamanlı PCR, sanırım) terminolojisini kullanmak yerine nicelleştirmeye herhangi bir atıfta bulunmaktan kaçınırlar (çünkü bu gerçekten yalnızca yarı nicelikseldir). Her iki durumda da, bu teknik teorik olarak uygun tahlil tasarımı ve standartları kullanılarak mRNA kopyalarının kantifikasyonunu yapabilir.
Genel ilke, cDNA'nın RNA'dan ters kopyalanmasından sonra normal bir PCR reaksiyonuna benzer şekilde amplifiye edilmesidir. Bu, hem ters transkripsiyon hem de qPCR reaktiflerini içeren ana karışımla tek bir reaksiyonda veya iki ayrı reaksiyonda, ilk önce bir RT ve ardından ortaya çıkan cDNA üzerinde standart bir qPCR gerçekleştirilerek gerçekleştirilebilir. Hepsi bir arada yöntem, daha az reaktif ve daha az zaman gerektirir, ancak her iki reaksiyonu aynı anda optimize etmek zor olabilir.
İşte qPCR tahlil tasarımı için iyi bir primer . Önceki cevapta belirtildiği gibi, niceleme, mevcut amplifikasyon ürününün miktarı ile ilgili bazı floresans ölçümlerinden gelir. Optimize edilmiş bir reaksiyonda, amplikonların sayısı her döngüde ikiye katlanmalı ve her reaksiyon kuyusu tarafından belirli bir floresans eşiğine ulaşılmadan önce kaç döngü meydana geldiğine bağlı olarak nicelendirmeye izin vermelidir. SyberGreen gibi ara boyalar, mevcut toplam DNA miktarını belirlerken, flüoresan problar ilgilendiğiniz gene daha spesifiktir. Yalnızca yarı kantitatif olduğu için, her plakaya standart bir konsantrasyonda bilinen bir seyreltme serisi eklenir ve miktar tayini için kullanılır. Standartlar, ilgilendiğiniz gen (DNA veya RNA) ile aynı materyal ve dizide olmalıdır ve muhtemelen deney numunelerinizdeki konsantrasyonu içerecek bir dizi konsantrasyonda seyreltilmelidir. Ayrıca, ölçümünüzün kalitesi tamamen standartlarınızın kalitesine bağlı olduğundan, standartlarınızın bozulma olasılığı konusunda dikkatli olmanız gerekir.
Alternatif bir yaklaşım, deneysel numuneden bağımsız olarak aynı seviyede yapısal olarak ifade edilen bazı referans genlere göre ilgilenilen bir geni ölçmektir. Bu yöntem (bazen delta-delta Ct yöntemi olarak adlandırılır ), standart bir eğri çalıştırma ihtiyacını ortadan kaldırır, ancak aynı ısıl döngü koşulları altında çalışacak primerler ve muhtemelen problarla kararlı bir referans geni tanımlamaya ek olarak ek reaksiyonlar veya çoklama gerektirir. ilgi geniniz.
Üçüncü bir seçenek, dijital PCR (dPCR) yoluyla mutlak kantifikasyondur . Genel olarak qPCR ile ilgili bir sorun, numuneleri iki veya üç kez çalıştırırken bile, yaklaşık 3 kattan daha küçük kantifikasyondaki farklılıkları güvenle çözmenin zor olabilmesidir. Mutlak miktarı girin. dPCR, reaksiyonu on binlerce nano-litrelik bölmeye bölerek çalışır, öyle ki her bölme ilgilenilen geninizin gerçek bir kopyasını içerebilir veya içermeyebilir. Floresans yalnızca reaksiyonun sonunda, her bölmenin amplifiye olup olmadığını belirlemek için kullanılır (bu nedenle dijital, her bölme 1 veya 0'dır). Kantifikasyon, pozitif bölmelerin negatif bölmelere oranı belirlenerek ve ayrık olasılık dağılımları için bir Poisson dağılımı ile karşılaştırılarak hesaplanır. QPCR'den çok daha ince çözünürlüğe sahip olabilir, sözde konsantrasyonlarda 1,2 katlık bir farkı güvenilir bir şekilde tespit edebilir, bunun karşılığında daha az dinamik aralığa sahip olması ve bu aralığın üst ve alt kısmına yakın nicelik tahminlerinde daha az güvene sahip olması. Ayrıca tüm sistem genellikle hemen hemen her seviyede (ekipman, reaktifler ve sarf malzemeleri) çok daha pahalıdır. Ancak çoğu gen ekspresyon tahlilinde, transkript seviyesinde 1.2 kat bir değişikliğin biyolojik sisteminizde anlamlı olup olmayacağını gerçekten kendinize sormanız gerekir.