RT-PCR: Non vedendo come può misurare i livelli di espressione di mRNA
Dalla mia comprensione, in RT-PCR iniziamo con una molecola di mRNA, usiamo l'enzima trascrittasi inversa per creare una copia di cDNA (creando quindi un ibrido di mRNA / cDNA a doppio filamento), degradiamo l'mRNA e infine creiamo un filamento complementare a il cDNA con una DNA polimerasi. Se alla fine stiamo creando DNA e questo viene duplicato ad ogni ciclo, come possiamo dedurre la quantità originale di mRNA nel nostro campione? Sembra che avremmo bisogno di combinarlo con qualche altro metodo, ma molte fonti che sto vedendo sembrano implicare che RT-PCR da solo sia sufficiente per "quantificare" la quantità di mRNA in un campione. Qualsiasi pensiero su questo è il benvenuto
Risposte
Potrebbe esserci una confusione terminologica. Esiste una PCR quantitativa in tempo reale, che a volte può essere chiamata RT-PCR. Esiste anche la PCR a trascrittasi inversa, che è anche chiamata in modo confuso RT-PCR. Per cercare di ridurre la confusione, la PCR quantitativa in tempo reale è anche chiamata RT-qPCR o qPCR.
Quello che descrivi nella tua domanda è il tipo di PCR a trascrittasi inversa. Viene utilizzato per l'amplificazione, non la quantificazione, del materiale di partenza.
La QPCR o PCR quantitativa, d'altra parte, utilizza coloranti fluorescenti per misurare la quantità di prodotto genico amplificato. Gli standard forniscono una misura di base della quantità di materiale genetico che dovresti aspettarti di vedere nel tempo, ad ogni ciclo PCR, per una data quantità di fluorescenza misurata. Misurare la fluorescenza del proprio campione nel tempo e confrontarlo con lo standard fornisce una stima di ciò con cui si è iniziato inizialmente.
Volevo solo approfondire la risposta precedente riguardante la confusione tra PCR in tempo reale (quantitativa) e trascrizione inversa (RT). RT-qPCR si riferisce alla PCR quantitativa in tempo reale, ma alcune organizzazioni si astengono da qualsiasi riferimento alla quantificazione (perché in realtà è solo semiquantitativa), utilizzando invece la nomenclatura rRT-PCR (PCR in tempo reale con trascrizione inversa, immagino). In entrambi i casi, questa tecnica è teoricamente in grado di quantificare le copie di mRNA utilizzando il design e gli standard del saggio appropriati.
Il principio generale è che, dopo che il cDNA è stato trascritto inversamente dall'RNA, viene amplificato in modo simile a una normale reazione PCR. Ciò può essere ottenuto in una singola reazione con la master mix contenente sia la trascrizione inversa che i reagenti qPCR, o in due reazioni separate, eseguendo prima una RT e poi una qPCR standard sul cDNA risultante. Il metodo tutto in uno richiede meno reagenti e meno tempo, ma può essere difficile ottimizzare entrambe le reazioni contemporaneamente.
Ecco un buon primer sulla progettazione del test qPCR . Come affermato nella risposta precedente, la quantificazione deriva da una certa misura di fluorescenza correlata alla quantità di prodotto di amplificazione presente. In una reazione ottimizzata, il numero di ampliconi dovrebbe raddoppiare a ogni ciclo, consentendo la quantificazione in base al numero di cicli che si verificano prima che ogni pozzetto di reazione raggiunga una soglia di fluorescenza specificata. Coloranti intercalanti come SyberGreen quantificano il DNA totale presente, mentre le sonde fluorescenti sono più specifiche per il tuo gene di interesse. Poiché è solo semiquantitativo, una serie di diluizioni standard di concentrazione nota è inclusa su ciascuna piastra e utilizzata per la quantificazione. Gli standard dovrebbero essere dello stesso materiale e sequenza del gene di interesse (DNA o RNA) e dovrebbero essere diluiti in un intervallo di concentrazioni che probabilmente includeranno la concentrazione nei campioni sperimentali. È inoltre necessario prestare attenzione alla possibilità di degradazione dei propri standard, poiché la qualità della quantificazione dipende interamente dalla qualità dei propri standard.
Un approccio alternativo consiste nel quantificare un gene di interesse relativo a un gene di riferimento espresso in modo costituzionale allo stesso livello indipendentemente dal campione sperimentale. Questo metodo (a volte chiamato metodo delta-delta Ct ) elimina la necessità di eseguire una curva standard, ma richiede reazioni aggiuntive o multiplexing, oltre all'identificazione di un gene di riferimento stabile con primer e possibilmente sonde che funzioneranno nelle stesse condizioni di termociclaggio come il tuo gene di interesse.
Una terza opzione è la quantificazione assoluta tramite PCR digitale (dPCR). Un problema con qPCR in generale è che, anche quando si eseguono campioni in duplicato o triplo, può essere difficile risolvere con sicurezza differenze di quantificazione inferiori a circa 3 volte. Immettere la quantificazione assoluta. Il dPCR funziona dividendo la reazione in decine di migliaia di compartimenti delle dimensioni di nanolitri, in modo tale che ogni compartimento possa contenere o meno una copia effettiva del gene di interesse. La fluorescenza viene utilizzata solo alla fine della reazione per determinare se ogni scomparto si è amplificato o meno (quindi digitale, ogni scomparto è un 1 o uno 0). La quantificazione viene calcolata determinando il rapporto tra compartimenti positivi e negativi e confrontandola con una distribuzione di Poisson per distribuzioni di probabilità discrete. Può avere una risoluzione molto più fine di qPCR, presumibilmente in grado di rilevare in modo affidabile una differenza di 1,2 volte nelle concentrazioni, con il compromesso che ha un intervallo dinamico inferiore con una fiducia ridotta nelle stime di quantificazione vicino alla parte superiore e inferiore di tale intervallo. Inoltre l'intero sistema è solitamente molto più costoso a quasi tutti i livelli (apparecchiature, reagenti e materiali di consumo). Ma con la maggior parte dei test di espressione genica, è davvero necessario chiedersi se un cambiamento di 1,2 volte nel livello di trascrizione sarà significativo nel tuo sistema biologico.