Loại bỏ hiệu ứng hàng loạt trong bản đồ nhiệt sau khi phân tích biểu hiện gen khác biệt
Tôi đang làm việc trên một tập dữ liệu trong đó bản sao đầu tiên của mỗi nhóm là một lô và bản sao thứ hai nằm trong lô thứ hai. Sau khi kiểm tra PCA
lô và thấy hiệu ứng hàng loạt trong PC1, tôi đã sử dụng removeBatchEffect
hàm từ limma để trừ hiệu ứng hàng loạt khỏi dữ liệu đếm của mình. Sau đó, sử dụng PCA mang lại cho tôi một âm mưu dường như không còn lại bất kỳ hiệu ứng hàng loạt rõ ràng nào! Tuy nhiên, không nên sử dụng hiệu chỉnh hiệu ứng hàng loạt để phân tích gen khác biệt mà nên sử dụng biến lô cùng với biến nhóm trong việc xây dựng model.matrix
. Vì vậy, tôi đã làm điều đó, chạylimma/voom
trên các số lượng chuẩn hóa và trích xuất các gen biểu hiện khác biệt. Tuy nhiên, khi tôi đang cố gắng tạo bản đồ nhiệt từ DEG, tôi vẫn thấy rằng các mẫu từ các lô khác nhau được nhóm riêng biệt, thay vì thấy nhóm các bản sao của cùng một mẫu. Vì vậy, câu hỏi của tôi là liệu tôi có nên sử dụng removeBatchEffect
dữ liệu đếm từ DEG và sau đó sử dụng tập dữ liệu đã chuyển đổi cho bản đồ nhiệt hay có cách khác để khắc phục điều này?
Trả lời
Đúng là đối với phân tích DE, người ta nên đưa lô vào công thức để tránh thay đổi số lượng ban đầu. Tuy nhiên, đối với mọi thứ khác, chẳng hạn như vẽ bản đồ nhiệt, việc sử dụng removeBatchEffects
là hoàn toàn tốt và (ít nhất là đối với tôi) là một quy trình tiêu chuẩn và được chấp nhận tốt. Về cơ bản nó không quan trọng bạn sử dụng gì để sửa hiệu ứng hàng loạt cho số lượng bạn sử dụng ở phía dưới. Kết quả có thể sẽ tương tự. Combat-Seq
từ gói sva là một bản thích ứng gần đây của ComBat dành riêng cho RNA-seq (theo những gì tôi hiểu) giải quyết tốt hơn bản chất đếm số nguyên của dữ liệu. Điều này hoạt động dựa trên số lượng thô và tránh các giá trị âm khét tiếng xảy ra đôi khi với cả limma
và Combat
. Sau khi áp dụng ComBat-Seq
các số liệu thô của bạn, bạn có thể chuẩn hóa chúng như bình thường bằng edgeR (hoặc bất kỳ công cụ nào bạn thích) và sau đó tạo các bản đồ nhiệt. Xemhttps://github.com/zhangyuqing/ComBat-seq. Kết quả DE vẫn phải đến từ đường ống DE bình thường với lô là hiệp biến như đã thảo luận ở trên.